동물실험 > 조직박편제작

<동물실험 - 조직박편제작>

 

1. 생검 (Biopsy)

2. 고정 (fixation)

3. 수세 (washing)

4. 탈수 (dehydration) / 치환 (Substitution)

5. 포매 (embedding)

6. 절편제작 (section)

7. 파라핀제거 (removing paraffin)

8. 수화 (hydration)

9. 염색 (staining)

10.탈수 (dehydration)

11. 봉합 (mounting)

12. 관찰 (observation)

13. 기록 (documentation)

 

1. 생검 (Biopsy)

 

의의 : 살아있는 생물의 조직을 진단이나 병의 변화를 알기 위하여 채취하는 행위

⟶ 혈액이 돌고 있을 때 생검을 완료하는 것이 이상적이다. 이는 검체의 변형(자가융해 등)을 막기 위한 것이다.

 

2. 고정 (Fixation)

 

기능 :

① 자가융해 방지 - 세포가 물질대사를 멈추었을 때 세포 내에 있는 lysosome의 원형질막이 더 이상 버티지 못해 분해효소를 방출(용출)라여 여러 물질들을 분해시킨다.

② 조직내 화학물질의 용해 및 부패방지

③ 조직손상의 방지

④ 미생물에 의한 부패방지

⑤ 염색에 대한 매염작용

 

고정 방법

: Immersion fixation (담금/침수 고정); 주로 검체의 8~10배에 해당하는 고정액에 검체를 담가 고정시킨다.

; 이외의 고정방법

chemical fixation - perfusion fixation(관류고정)/ Infusion fixation(주입/투입고정)/ vapor fixation(증기고정)

physical fixation - heating fixation / freezing fixation / microwave fixation

 

 

3. 수세 (washing)

 

수세시간은 고정시간과 동일하게 한다.

조직을 카세트에 넣고 주로 흐르는 물에 24h동안 두기도 한다.

PBS에 담가두기도 한다.

 

4. 탈수 (dehydration) / 치환 (substitution) : 기계

 

탈수

의의 : 여러 가지 목적에 따라 기체․액체․고체 속에 수분이 섞여 있으면 불편한 경우에 행하며, 특별한 경우에는 건조라고도 함.

또한 paraffin은 유기용매로 수분이 남아있을 경우 침투가 잘 되지 않으므로 제거하여 준다.

⟶ 탈수액은 조직의 부피의 10배 이상이 좋다.

 

우선 낮은 농도의 알코올에서 점차적으로 높은 농도의 알코올에 담가 수분을 제거한다.

 

치환

의의 : 검체의 내부의 Alcohol 또는 clearing agents을 이후 과정을 진행하기 위해 바꾸어주는 행위

paraffin이 유기용매이므로 alcohol과 paraffin 모두와 친화력이 있는 xylene으로 치환시킨 후 조직에 paraffin을 침투시킨다.

 

과정 :

clearing or dealcoholization

permeation or infiltration

 

5. 포매 (embedding)

 

의의 : 조직괴를 현미경관찰 하기 위하여 얇은 절편제작이 용이하도록 그에 맞는 강도와 조직전체가 일정한 강도를 유지시키며, 조직 내부에 공간 또는 틈에 의해 박절 시 조직의 구조변경을 막기 위함.

⟶ embedding 또는 blocking이라 함.

 

포매 틀에 뜨거운 paraffin을 붓고 조직을 박절 할 부분이 바닥으로 가게 심고 paraffin을 부어준다. 그리고 카세트를 틀에 부치고 굳힌다.

실온에 보관이 가능하며, 박절하기 전 하루정도 냉동실(-2oC)에 넣어둔다.

 

6. 박절 (section)

 

의의 : 조직블럭을 얇게 잘라내어 관찰이 용이한 상태로 만드는 과정. 과정에서 조직의 종류와 부위에 따라 박절 두께를 조절할 수 있다.

 

박절에 영향을 주는 요인 :

① 칼의 예민도

② 칼에 묻어 있는 기름

③ 먼지의 유무

④ clearance angle (틈의 각)

⑤ 당기는 각 (활주형)

⑥ 칼 또는 검체의 운동 성질

 

과정 :

① 블록고정

② 칼날의 위치와 각도 조정

③ 블록 접근

④ 잉여 파라핀 제거 (10um)

⑤ 박절 (3~7um)

⑥ Alcohol에서 큰 주름 펴기

⑦ 항온수조에서 작은 주름 펴기

⑧ 슬라이드 부착 후 건조

 

<염색>

7. 파라핀제거 (removing paraffin)

 

의의 : 염색을 위해 파라핀 제거

 

과정 :

주로 2차 정도 Xylene에 30min. 정도 담궈둔다.

 

 

8. 수화 (hydration)

 

의의 : 염색용액인 Hematoxylin과 Eosin이 수용성 용액이기 때문에 침투가 잘 되게 하기 위하여 함수과정을 거친다.

 

과정 :

탈수과정과는 반대과정으로 높은 농도의 알코올부터 점차적으로 낮은 농도의 알코올에 담궈준다.

각 3min.

 

9. 염색 (staining)

 

의의 : 조직의 구조를 더 자세히 관찰하기 위함.

 

Hematoxylin : 조직에서 핵소체와 rEM, 이질염색질을 염색

청색

① 과염 ⟶ 탈색 : 퇴행성 염색 (주로 사용)

② 과염 x : 진행성 염색

Eosin : O- 때문에 양성에 잘 붙는다.

세포질, RBC, Mitochondria, 근섬유 등에 잘 염색

 

과정 : alcohol serise가 끝나면 흐르는 물에 10~15min. washing

① Hematoxylin 5min.

② washing 3min.

③ HCl 3~4 drop (Hematoxylin 과염 제거)

④ washing 3min.

⑤ amino acid 4 drop (중화 Hematoxylin이 청색)

⑥ washing 2min.

⑦ Eosin 20sec.

⑧ washing 1min.

 

10.탈수 (dehydration)

 

의의 : 조직에 수분을 빼고 봉합용액을 침투시켜 조직의 보관을 용이하게 한다.

 

과정 : 낮은 농도의 알코올에서 높은 농도의 알코올에 조직 슬라이드를 담군 후 xylene에 담근다.

 

11. 봉합 (mounting)

 

의의: 조직의 보관을 용이하게 한다.

 

과정 : canada balsam 용액을 조직 슬라이드에 1~2방울 뿌려준 후 cover glass로 덮어 말려준다. 이후 글라스 위에 지저분한 balsam을 xylene으로 닦아준다.

 

12. 관찰 (observation)

: 사진으로 조직의 사진을 찍는다.

 

13. 기록 (documentation)

 

 

※ 인용문헌

: 2011년도 순천향대 생명과학과 조직학실험 유인물