(IHC)Immunohistochemistry

<동물실험-Immunohistochemistry>

①     Fixing and embedding the tissue

②     Cutting and mounting the section

③     Deparaffinizing and rehydrating the section

④     Antigen retrieval

⑤     Immunohistochemical staining

⑥     Counterstaing (if desired)

⑦     Dehydrating and stabilizing with mounting medium

⑧     Viewing the staining under the microscope

[ protocol]

①     Fixation

10% neutral buffered formalin(NBF)가 가장 보편적

:고정은 18h-24h가 가장 이상적

→ Fixation 시간이 너무 적으면 : section에 너무 강한 신호. 중간 부분에 signal전달 안됨

 Fixation 시간이 너무 길면 : epitope를 막아 antigen retrieval이 잘 안됨

→ tissue section : 5um가 가장 적합하다.

②     Deparaffinization

: 파라핀절편실험과 동일하게 한다.

Xylene→높은 농도의 Alc→낮은 농도의 Alc

유수로 Wash

;조직 표면이 마르지 않게 한다. 표면이 건조하면 antibody가 non-specific하게 붙는다. 또 stain이 진하게 된다.

③     Antigen retrieval

: 안 하는 경우도 있다. 조직이 슬라이드에 잘 떨어지는 조직은 하지 않는다.

A.     Buffer solutions for heat-induced epitope retrieval

B.     Heat-induced epitope retrieval methods

C.     Enzymatic antigen retrieval

④     Immunohistochemical staining

: Incubation 할 때는 조직이 마르는 것을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 용기에 보관하고 용기 바닥에 습한 종이를 깔아둔다.

A.     Day 1

                i.         0.3% H₂O₂ in MetOH에 30min.

: 50ml MetOH에 H₂O₂  500λ

               ii.         TBS(1x)에 5분간 3번 wash

TBS는 사용 전에 30분 정도 water bath에 담궈둔다.

              iii.         슬라이드에 조직보다 1~2mm 정도 떨어지게 원형으로 표시해 둔다. (조직이 잘 보이지 않으므로 표시해둔다.)

 

 

              iv.         조직 위에 blocking 용액을 조직을 다 덮을 정도 뿌린다. 30분 반응

               v.         슬라이드를 살짝 털어 용액을 제거하고, 조직 주위의 용액을 티슈로 조심히 제거한 후 일차 항체를 동일하게 조직에 떨어뜨리고 4^oC에서 16h정도 반응시킨다.

B.     Day 2

                i.         10분 정도 실온에 조직 슬라이드를 꺼내둔다.

               ii.         1x TBS에 5분씩 3번 wash

              iii.         TBS를 닦아내고 이차항체를 한 방울씩 조직 위에 떨어뜨린다. 30분 반응

              iv.         1x TBS에 5분씩 3번 wash

               v.         TBS를 닦아내고 ABC용액를 한 방울씩 조직 위에 떨어뜨린다. 30분 반응

              vi.         1x TBS로 5분씩 3번 washing

             vii.         DAB 반응 (현미경으로 보면서 약 20초씩)

            viii.         유수에 wash

              ix.         이후 hematoxylin 염색 및 봉합은 H&E와 동일(단 eosin은 하지 않는다)

 

l  용액 만들기

1.      TBS (Tris buffer saline):

10x기준

NaCl  : 87.7g

Tris-HCl : 12.1g

DW : 1000g

pH 7.3

2.      이차항체 Kit

A.     Blocking solution

TBS : 10ml

Solution : 1drop

B.      Secondary antibody

Blocking solution :